Investigadores del CSIC explican cómo se desarrolla este test que amplifica miles de millones de veces el material genético del virus hallado en la muestra de un paciente infectado.
Las pruebas PCR se han convertido en una herramienta vital para determinar el alcance de la pandemia de Covid-19 porque son las que ofrecen mayor fiabilidad. ¿Pero cómo funciona esta prueba? Básicamente, consiste en amplificar un fragmento del material genético del paciente para observar si contiene material genético (ARN) del virus SARS-CoV-2. En el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), los investigadores del Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols (IIBM-CSIC-UAM), durante siete semanas comprendidas entre mayo y junio, han analizado 10.000 muestras de pacientes de 81 residencias de personas mayores y de 13 residencias de personas con discapacidad de la Comunidad de Madrid.
“Una PCR es una fotografía instantánea en un momento determinado. Lo que “miramos” en una PCR es si una persona tiene el virus o no en ese momento concreto. Puedes ser negativo al tomarte la muestra y después infectarte”, explica la investigadora del CSIC Gemma Rodríguez-Tarduchy, responsable del servicio de Genómica del IIBM-CSIC-UAM.
La prueba PCR (Polymerase Chain Reaction, o reacción en cadena de la polimerasa) es una técnica desarrollada en los años 80 del siglo XX por Kary Mullis, quien posteriormente ganaría el premio Nobel. Consiste en replicar de forma específica el material genético extraído a un paciente hasta obtener millones o miles de millones de copias; es decir, hasta conseguir la cantidad suficiente para analizarlo y para que el resultado de ese análisis tenga un alto grado de fiabilidad. Esta capacidad de amplificación la convierte en una herramienta muy útil no sólo en investigación biomédica sino también en la obtención de un diagnóstico, en análisis criminológicos o en la realización de estudios paleontológicos. Actualmente, las aplicaciones de la técnica PCR son innumerables.
“Muchas veces el problema que nos encontramos cuando tomamos una muestra es el poco material genético del que disponemos para trabajar. Por lo tanto, lo que hace una PCR es amplificar, fotocopiar el material genético a partir de un molde original. Cuantas más fotocopias hago, más cantidad tengo de ese molde original. Una vez que tengo mucho de ese molde, ya soy capaz de analizarlo”, añade.
Fases de una PCR, desde la toma de la muestra al diagnóstico
El ciclo de las pruebas PCR tiene dos grandes partes: obtención de la muestra y realización del análisis. La obtención se compone de tres pasos: toma de la muestra, inactivación del virus y extracción del material genético. Sólo posteriormente es cuando se realiza la técnica de análisis PCR propiamente dicha.
Primer paso: conseguir la muestra del paciente. El personal sanitario introduce un hisopo (bastoncillo) por la vía nasofaríngea del paciente hasta tomar la muestra. Este hisopo se inserta en un tubo identificado con un código que permite la trazabilidad de la muestra. Además, en su interior, el tubo contiene un líquido que estabiliza la muestra y la conserva.
Segundo paso: inactivar la muestra. Consiste en anular la capacidad contagiosa del virus en un laboratorio de contención biológica de nivel 3. Este paso se realiza en colaboración con el Departamento de Medicina Preventiva, Salud Pública y Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Madrid. “Cuando la muestra llega al laboratorio, como no sabemos si es infectiva o no, lo primero que tenemos que hacer es inactivarla. La inactivación simplemente consiste en añadir un buffer, un líquido que inactiva el virus. El material genético permanece, pero el virus deja de ser infectivo”, indica Rodríguez-Tarduchy.
Tercer paso: extraer el material genético. Al ser tomada directamente del paciente, la muestra contiene tanto células del individuo, con sus proteínas, ADN y ARN, como ARN y proteínas virales (en el caso de que la persona esté infectada).
“Los virus infectan las células para multiplicarse, es decir, inyectan su material genético (ARN en este caso) dentro de esas células. Por eso tenemos que romper la célula infectada y la cápside del virus para liberar su ARN”, añade la investigadora. Se emplea para ello una solución (buffer de lisis) que produce la rotura y libera el material genético.
El siguiente paso consiste en separar el ARN del resto de componentes celulares, es decir, “únicamente nos interesa el material genético, nuestro molde para la PCR”, explica.
Rosa Guerrero López. Investigadora en el Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols (CSIC-UAM) y CIBERER
Para conseguir aislar el material genético (ARN) del resto de elementos, entran en escena dos robots especializados que posee el IIBM gracias a una donación de la empresa Alantra para este fin, y que permiten procesar, en algo más de una hora, 96 muestras de manera simultánea. El procedimiento de separación es laborioso, según explica Rosa Guerrero, investigadora del IIBM y del Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER): “primero vertimos bolitas magnéticas en la muestra de cada paciente, y después la introducimos en el robot. Lo que hace el robot es agitar las muestras con las bolitas magnéticas, que llevan asociadas una sustancia química para que éstas se unan al material genético. El robot introduce barritas metálicas en cada pocillo de reacción. De esta manera, mediante la fuerza magnética retiene el material genético unido a las bolitas magnéticas, mientras que el resto de material es expulsado. Tras sucesivos lavados para eliminar todo aquello que pudiera interferir o contaminar la identificación posterior, lo que hacemos es obtener el material genético limpio para hacer la determinación del ARN viral”.
Momento de realizar la técnica RT-PCR
Análisis PCR: tras tomar la muestra, inactivar el virus y extraer su material genético, llega el momento realizar la prueba PCR. Para desarrollar esta última fase, las muestras se trasladan unos pocos metros hasta el laboratorio de genómica del IIBM. En esta nueva ubicación y haciendo alusión únicamente a la duración de la técnica PCR, el resultado de las muestras se obtiene en 45 minutos.
Convertir ARN en ADN (RT-PCR): Para amplificar el material genético es necesario utilizar la enzima ADN polimerasa. Sin embargo, esta enzima solo actúa sobre ADN (doble cadena de nucleótidos) mientras que la muestra obtenida es ARN (una cadena de nucleótidos). Ello hace que sea necesario convertir el ARN viral en ADN complementario. Este proceso se conoce como retrotranscripción y se lleva a cabo gracias a una enzima conocida como transcriptasa reversa.
La enzima polimerasa produce millones de copias: Una vez que la transcriptasa ha generado la cadena de ADN, que es complementaria a la cadena de ARN del virus, funciona como un “molde” del material genético del virus. A ese molde se le añade entonces ADN polimerasa, una enzima (catalizador biológico) que, mediante varios ciclos con cambios periódicos de temperatura, realiza millones de copias para amplificar el material genético del virus.
Sondas fluorescentes que revelan tres genes del SARS-CoV-2: durante esta fase el objetivo es identificar el virus amplificando de forma específica tres genes del SARS-CoV-2 (tres secuencias específicas del ARN del coronavirus). Para determinar la presencia de los genes se usan oligonucleótidos específicos para secuencias del genoma de SARS-CoV-2. En la misma reacción se incluyen sondas fluorescentes específicas de las regiones amplificadas. La fluorescencia emitida se detecta en el mismo momento que se realiza la prueba gracias a equipos de PCR más sofisticados que se conocen como equipos de PCR a tiempo real. “Si detectamos emisión de fluorescencia de los tres fluorocromos en la muestra, ésta es positiva. En caso contrario consideramos la muestra como negativa”, indica Gemma Rodríguez-Tarduchy.
Como la fluorescencia generada revela la presencia de tres secuencias virales simultáneamente, la PCR proporciona un alto grado de fiabilidad, obviando de forma importante lo que se conocen como falsos positivos.
“Si hubiéramos utilizado solamente oligonucleótidos y sondas fluorescentes para un único gen viral, como existen varios tipos de coronavirus, podríamos haber diagnosticado un falso positivo. Pero como “miramos” tres secuencias específicas de SARS-CoV-2, si esos tres genes salen positivos, es decir, si detectamos emisión de fluorescencia correspondiente a los tres, entonces esa muestra es, con un alto grado de fiabilidad, positiva para SARS-CoV-2”, añade.
Con el diagnóstico finaliza un proceso que hoy en día se conoce coloquialmente como PCR. Un procedimiento que, si desde el principio hasta el final se desarrolla de manera secuencial, apenas se prolonga 24 horas.
“Lo que quiero dejar claro es que la PCR es una fotografía instantánea que refleja la situación de un individuo en un momento determinado. Sólo revela la presencia del coronavirus en la muestra en ese preciso momento”, concluye.
Alejandro Parrilla / CSIC Comunicación
